血管平滑肌细胞（vsmcs）是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分，受到垂直于血管的压力，导致血管扩张以维持正常的血管稳态。一些报告表明，病理性拉伸导致 vsmc 增殖、细胞死亡、表型转换和迁移，导致血管重塑。然而，机械拉伸作用于平滑肌细胞的特定分子机制仍需要进一步探索。
ezh2是polycomb基因家族的成员，polycomb基因家族是一组重要的表观遗传调控基因，可抑制转录。ezh2是一种组蛋白甲基转移酶，它通过催化组蛋白h3赖氨酸27（h3k27）的甲基化以控制各种基因表达，从而调节细胞的正常生理功能。许多研究发现，ezh2具有促癌的作用，抑制ezh2有可能提高某些癌症的抗肿瘤免疫能力。近年来，ezh2因其在心血管疾病中的作用而受到越来越多的关注，因为研究结果对于指导靶向ezh2的抗肿瘤药物在心血管疾病患者肿瘤中的应用具有重要意义。
研究表明，高幅度且均匀的流体剪切应力会降低内皮细胞中ezh2的表达。滤泡间表皮干细胞的长期机械拉伸增加了体内和体外的 ezh2 水平。ezh2在通过机械拉伸调节平滑肌细胞功能中的作用不太明确。
在山东省心血管疾病转换医学重点实验室、山东大学齐鲁医院心血管内科的一项研究中，探索了ezh2在机械拉伸下血管重塑发展中的作用，以及在小鼠体内和体外人主动脉平滑肌细胞（hasmcs）中的潜在机制。
过度的机械拉伸会降低 vsmc s中 ezh2 的表达
如图1 a、b所示，腹主动脉缩窄（aac）小鼠胸主动脉培养基中ezh2的表达在1、2和3周时逐渐低于假手术对照组小鼠的表达。蛋白质印迹分析表明，aac小鼠ezh2的相对蛋白表达水平显著降低（图1 c）。在人vsmcs上进行进一步的体外实验，以验证ezh2响应机械拉伸的变化。使用循环拉伸加载系统，用机械拉伸（12%，1hz）处理hasmcs，持续不同时间（0，6，12，24或48小时），结果表明，ezh2蛋白水平随时间推移逐渐下降（图1 d、e）。hasmcs在无拉伸或机械拉伸（12%）下处理24 h后，用机械拉伸（12%）处理的细胞中ezh2表达显著降低（图1 f-h）。
图1 aac后vsmcs中ezh2在体内和体外机械拉伸下表达降低。
小鼠平滑肌（sm）特异性过表达ezh2可改善血管重塑
为了探索平滑肌ezh2在体内的作用，向小鼠注射了带有ezh2的腺相关病毒（aav-ezh2）或aav-gfp作为对照2周。结果显示，aav-gfp在血管平滑肌细胞中表达。通过aav-ezh2和aav-gfp小鼠的wb检测到血管组织中ezh2的表达。将aav-ezh2和aav-gfp小鼠随机分为假手术组和aac组，实验共分为4组：对照组+假手术组、对照组+aac组、aav-ezh2+假手术组和aav-ezh2+aac组。通过免疫组织化学检测血管组织中ezh2表达，表明aav-ezh2上调aac小鼠血管平滑肌细胞中ezh2表达。he染色显示，与对照+aac组小鼠相比，aac可显著增加对照组小鼠胸主动脉中层厚度，而aav-ezh2可显著减少aav-ezh2 +aac小鼠主动脉中层厚度。
ezh2 有助于减少 aac 后 vsmc 细胞凋亡
目前尚不清楚ezh2如何通过影响平滑肌细胞的功能来影响血管重塑。因此，实验试图确定ezh2过表达是否通过细胞凋亡减少了中膜平滑肌细胞的数量。结果发现，aac后平滑肌细胞的凋亡显著增加，但在ezh2过表达后显著降低（图2 a、b）。提取小鼠胸主动脉血管进行蛋白质印迹，进一步确认了上述结果（图2 c、d）。
图2 ezh2有助于aac后vsmc凋亡的减少。
ezh2 有助于减少机械拉伸下 vsmc 凋亡
ezh2在机械拉伸下对平滑肌细胞的影响的作用尚不清楚。使用循环拉伸加载系统，用不同幅度的机械拉伸（静态，10%，12%，15%）处理hasmcs，ezh2蛋白水平随着强度的增加而逐渐降低，细胞凋亡逐渐增加（图3 a-c）。在12% 拉伸刺激24小时后分析细胞裂解物的凋亡指数（图3 d、e）。实验用ezh2腺病毒上调vsmcs中的ezh2蛋白表达。简而言之，hasmcs转染腺病毒（图3 f）。用adv-ezh12转染后用12%拉伸刺激hasmcs 24小时，然后检测细胞凋亡。实验表明，12% 拉伸显著促进hasmc凋亡，ezh2过表达抑制hasmc凋亡（图3 g-k）。
图3 ezh2有助于减少机械拉伸下的vsmc细胞凋亡。
ezh2 不是通过增殖和表型转换来改善血管重塑
目前尚不清楚ezh2是否通过影响平滑肌细胞凋亡以外的功能来改善血管重塑。免疫组化检测血管组织中pcna（细胞增殖核抗原）表达，结果显示，aac手术组上调pcna在血管平滑肌细胞中的表达，而aav-ezh2+aac小鼠与aac手术组差异无统计学意义。此外，机械拉伸下调平滑肌细胞中sm22α，α-sma的表达，而ezh2的过表达不会逆转这些影响。
机械拉伸通过 yap-tead1 通路调控 ezh2
实验证实了机械拉伸对ezh2的调节作用，但这种调节作用的机制仍有待阐明。先前的研究表明，生物力学拉伸诱导的yap-tead通路的激活可以调节smcs的功能。因此，实验假设机械拉伸通过yap-tead1通路调节ezh2。首先，发现机械拉伸通过降低yap磷酸化来诱导yap活性（图4 a）。当使用tead1特异性小干扰rna敲低tead1表达或小分子抑制剂维替泊芬（vp）在机械拉伸下破坏yap-tead1相互作用时，发现ezh2的表达显著升高（图4 c、d）。
为了进一步验证yap-tead1对ezh2启动子活性的调控作用，实验生成了含有野生型（wt）结合区域的ezh2基因启动子的荧光素酶报告基因，并进行了双重荧光素酶测定。数据证实，yap过表达显著抑制wt启动子荧光素酶活性（图4 e）。为了进一步测试yap-tead1是否可以通过预测的结合区域激活ezh2基因启动子活性，实验生成了含有野生型（wt）或突变型（mut）结合区域的ezh2基因启动子的荧光素酶报告基因，并进行了双荧光素酶测定。数据显示，与wt启动子活性水平相比，mut型启动子活性水平显著增强（图4 f）。此外，tead1结合富集在ezh2基因的atg密码子上游的712 bp和815 bp之间（图4 g、h）。此外，我们发现整合素β1在机械拉伸作用下升高，ezh2过表达后其表达降低。
图4 机械拉伸通过yap-tead1通路调节ezh2。
过表达 ezh2 增强了 aac 后 h3k27me3 的减少
在aac小鼠胸主动脉中膜中检测到h3k27me3的表达，与假手术对照小鼠相比，aac小鼠在1、2和3周时其表达逐渐降低。然后，发现ezh2的过表达增强了aac后h3k27me3的减少。为了探索gsk-j4（h3k27me3 抑制剂）是否与ezh2过表达病毒具有相同的效果，实验共设置4组：对照+假组、对照+aac组、gsk-j4+假组和gsk-j4+aac组。对这4组血管的免疫荧光分析表明，gsk-j4可以显著增强aac引起的h3k27me3的降低。
gsk-j4 减少平滑肌细胞凋亡并改善血管重塑
为了研究gsk-j4是否也通过减少平滑肌细胞凋亡来改善血管重塑，实验进行了he染色。结果表明，与对照+aac小鼠相比，aac显著增加了对照组小鼠胸主动脉中层厚度，而gsk-j4显著降低了gsk-j4+aac小鼠主动脉中层的增厚。此外，还检测了gsk-j4小鼠的凋亡水平。tunel染色证明，aac后平滑肌细胞凋亡显著增加，gsk-j4处理后显著降低。
图5 病理机械拉伸通过降低ezh2的表达加重血管重塑。
目前的研究发现，ezh2是机械拉伸诱导的vsmc细胞凋亡的重要介质。该实验数据显示，机械拉伸会降低体内和体外ezh2的表达。在体内，发现smcs中ezh2基因的过表达增加了h3k27me3的表达，从而减弱了aac诱导的血管重塑。在体外，机械拉伸通过yap-tead1通路下调ezh2并导致vsmc细胞凋亡增强。该研究是第一个报告机械拉伸对平滑肌细胞中ezh2表达的直接影响及其潜在机制的研究。
参考文献：zhong hy, yuan c, liu xl, wang qq, li x, zhao yc, li x, liu dd, zheng tf, zhang m. mechanical stretch aggravates vascular smooth muscle cell apoptosis and vascular remodeling by downregulating ezh2. int j biochem cell biol. 2022 oct;151:106278. doi: 10.1016/j.biocel.2022.106278. epub 2022 aug 17. pmid: 35985452.